Extraction sur phase solide : la méthodologie à suivre pour réussir vos préparations d’échantillons

A. Introduction à l’extraction sur phase solide (SPE)

Partie intégrante d’une analyse, la préparation d’échantillons a considérablement évolué ces dernières années. C’est sans aucun doute l’étape la plus importante du processus analytique. Certaines études montrent que la préparation d’échantillons représente en général environ 60% du temps de travail d’un technicien de laboratoire et qu’elle est l’une des principales sources d’erreurs entachant le résultat de l’analyse. Avec ce constat, on comprend mieux pourquoi une bonne préparation d’échantillons influe directement sur la limite de détection, la reproductibilité et la répétabilité de l’analyse. Son impact sur la qualité de l’analyse est fondamental.

La multitude de matrices à traiter (sang, plasma, eaux, organes, viandes, poissons, légumes,…) nécessitent l’emploi de techniques variées : filtration, dialyse, extraction liquide – liquide, extraction sur phase solide (SPE). Parmi celles-ci, l’extraction en phase solide est certainement la technique qui a le plus évolué dans la dernière décennie. Elle est aujourd’hui présente dans la plupart des laboratoires et permet de réaliser des purifications et une concentration efficaces de l’échantillon avant l’analyse HPLC, HPLC/MS, GC ou GC/MS. Le niveau de qualité requis pour les produits de SPE s’est donc renforcé. Ainsi, de nouvelles innovations technologiques telles que les polymères à hautes surfaces spécifiques, les polymères échange d’ions et les silices sphériques pures sont devenues incontournables.

Rendement, capacité, sélectivité, reproductibilité sont les principales vertus qu’attendent les analystes de leurs méthodes de traitement d’échantillon. Grâce à leur expérience, nos laboratoires ont développé la marque Upti-Clean®, supports silices sphériques purs ainsi que les marques Atoll™, PolyClean™ et BioP™, polymères sphériques ultrapurs.
Ces gammes de produits répondent parfaitement aux besoins des méhodes modernes et concourent à les rendre plus fiables, plus reproductibles et plus robustes.

B. Méthodologie générale SPE

Tous les adsorbants remplis dans des cartouches, colonnes ou plaques 96 puits sont à usage unique (exceptées les colonnes de trapping “on-line” montées en ligne sur un système HPLC). L’utilisation d’appareil est recommandée pour la percolation des différents solvants (appareil à vide, appareil à pression positive, seringues).

Le choix de la colonne est défini par le volume de l’échantillon, sa concentration en analytes et les types d’échanges recherchés. Dans l’environnement, des volumes de plusieurs centaines de millilitres peuvent être nécessaires pour une bonne pré-concentration (ex. : polluants organiques). En revanche, dans l’industrie pharmaceutique, le volume des échantillons à purifier n’est que de quelques millilitres. L’adsorbant choisi doit avoir une excellente affinité pour les composés cibles. Il doit également présenter un minimum d’affinité avec les interférents de la matrice.
Un protocole SPE se décompose en plusieurs étapes.

1. Conditionnement puis Equilibration
	Étape d’activation avec un solvant organique ou un mélange de solvants pour permettre l’élimination des contaminants et favoriser les échanges dans l’adsorbant. Cette étape permet également une meilleure mouillabilité des frittés. L’hexane, le cyclohexane ou le dichlorométhane sont des solvants régulièrement utilisés en mode “phase normale” pour conditionner la silice vierge ou la silice greffée aminopropyle (R-NH2), dihydroxypropyle (R-R’OH-R”OH), cyanopropyle (R-CN), … En mode “phase inverse”, pour des silices greffées C18, C8, C2, phényle, cyclohexyle, on emploie couramment le méthanol voire l’acétonitrile.
2. Introduction de l’échantillon
	L’échantillon est déposé sur la partie supérieure du lit de l’adsorbant. Les impuretés n’ayant aucune affinité avec l’adsorbant ne sont pas retenues. D’autres le sont plus ou moins fortement que les composés d’intérêts. Pour apporter un maximum d’efficacité à la purification, la vitesse d’écoulement de l’échantillon doit être contrôlée. Les valeurs expérimentales des débits observés pour des granulométries d’approximativement 50 µm sont comprises entre : 0,7 – 1 mL / min pour des colonnes de 1 mL 2 – 3 mL / min pour des colonnes de 3 mL 5 – 7 mL / min pour des colonnes de 6 mL 7 – 10 mL / min pour des colonnes de 15 mL 10 – 15 mL / min pour des colonnes de 25 mL 0,6 – 1,1 mL / min pour des plaques 96 puits 4 – 5 mL / min pour des cartouches fermées Lors des premiers essais, il est impératif de vérifier que tous les composés d’intérêts de l’échantillon ont été fixés sur l’adsorbant, ce qui implique d’analyser la fraction de percolation. En échange d’ions, le pH de l’échantillon doit être identique au pH du tampon utilisé lors de l’étape d’activation de l’adsorbant. La percolation des échantillons visqueux à travers une colonne peut être facilitée en utilisant des adsorbants de 90 à 140 µm. La capacité d’échange et la sélectivité ne sont pas affectées.
3. Lavage > Elimination des produits secondaires
	Étape qui permet l’élimination d’impuretés possédant moins d’interactions avec l’adsorbant que le ou les composés d’intérêt. D’autres solutions (solvants ou mélanges de solvants) peuvent être utilisées pour une efficacité plus importante. Elles doivent avoir le plus d’affinité possible avec les impuretés et le moins possible avec les composés d’intérêt pour ne pas les éluer à l’issue de cette étape (Attention à la polarité et au pH des solvants de lavage).
4. Séchage > Elimination des traces de solvant de lavage
	Faire circuler de l’air pendant 2 à 5 minutes à travers la cartouche pour évaporer les traces de solvant de lavage. Cette étape améliore le rendement d’extraction.
5. Elution > 100% des composés élués par le solvant
	Étape qui consiste à récupérer 100 % des composés d’intérêt présents sur l’adsorbant. Le solvant ou mélange de solvants utilisé doit avoir le maximum d’interactions avec les analytes et le moins possible avec les autres interférents qui peuvent rester adsorbés. Le solvant d’élution doit être le plus efficace possible, son volume doit être faible de manière à obtenir un facteur de pré-concentration très important. Un adsorbant à faible diamètre de particules (ex : 30 ou 50 µm) garantira un volume d’élution plus faible qu’un adsorbant de granulométrie plus grande (ex : 90, 140 µm). Par contre la vitesse d’écoulement des fluides sera plus lente avec un risque potentiel de colmatage pour les échantillons sirupeux.
6. Séchage
Si nécessaire, l’éluat peut être séché avec du sulfate de sodium anhydre pour éliminer les éventuelles traces d’eau.
7. Concentration
Le but de cette étape est de concentrer les composés d’intérêt dans la fraction d’élution. Elle est généralement réalisée par évaporation d’une partie du solvant. Le concentré obtenu est soit directement utilisable, soit repris dans un solvant d’analyse. Une fois optimisées, ces étapes garantissent une analyse plus sensible (augmentation de la concentration des composés d’intérêt), plus reproductible et résolutive (élimination des impuretés qui peuvent modifier la robustesse de l’analyse).

C. Définition du “volume lit”

Pour les étapes de conditionnement, de lavage et d’élution, les volumes théoriques sont de 2 à 3 fois le volume de l’adsorbant ou “volume lit” soit :

• Pour 100 mg de silice 60 A 50 µm : ~120 µL
• Pour 500 mg de silice 60 A 50 µm : ~ 600 µL
  Pour 100 mg de polymère : ~ 180 µL

Une masse d’adsorbant trop élevée induit une élution incomplète des composés d’intérêt ou une dilution de l’échantillon par un volume d’élution trop important. Une masse d’adsorbant trop faible induit une rétention incomplète des composés d’intérêt que l’on retrouve dans la fraction de percolation ou dans le solvant de lavage. Ces deux situations conduisent à des taux de récupération plus faibles que prévus.

1. Choix de l’adsorbant SPE ?

Quel que soit l’échantillon à purifier (qu’il soit issu de l’environnement, du domaine pharmaceutique, du domaine cosmétique, de l’agrochimie, etc. …), il est fondamental de choisir son adsorbant d’extraction sur phase solide de façon précise.
Le choix de cet adsorbant permettra de définir une sélectivité spécifique aux composés d’intérêt ainsi qu’une capacité de charge suffisante à l’entière adsorption de ceux-ci.

On rencontre en général deux grandes familles :

• Les silices
• Les polymères

Ces deux familles possèdent des caractéristiques très différentes.
Leurs applications, avantages et inconvénients sont divers et variés.

2. Polymères

• Très stables chimiquement, ils résistent le plus souvent à un pH compris entre 1 et 14.
• Faiblement sélectifs comparés aux silices greffées (exceptés les polymères échange d’ions).
• Ils possèdent une capacité de charge bien supérieure aux silices traditionnelles et permettent la purification d’un très grand nombre de molécules ou de familles de molécules quelle que soit la matrice (eaux, huiles, plasma, urines, …)

La masse de composés adsorbables peut aller jusqu’à 30% de la masse du polymère contenue dans la colonne. Il est donc possible de réaliser le même travail de purification avec une quantité de polymères 2 à 3 fois moindre que celle d’une silice. Le volume d’élution est beaucoup plus faible, ce qui conduit à une concentration plus importante, une durée de l’évaporation réduite et finalement une préparation d’échantillon plus rapide.

3. Silices

• Stabilité chimique moins importante que les polymères, elles sont stables à un pH compris entre 2 et 7,5.
• Beaucoup plus sélectives que les polymères avec une capacité de charge moins importante du fait de leur plus faible surface spécifique (de l’ordre de 3 à 10% de la masse d’adsorbant), les silices restent toujours des adsorbants de référence très utilisés.

On distingue 4 familles de silices identifiables par leur mode de fonctionnement ainsi que par leur sélectivité :

a. Silices pour mode “Phase inverse”

En mode “Phase Inverse”, les greffons hydrophobes fonctionnent selon les interactions de type Van der Walls. La purification permet un isolement de familles de composés apolaires ou faiblement polaires.
L’ajout de tampon est préférable lorsque les composés sont ionisables (acides, bases).
Les phases apolaires non post-silanisées (non end capped) donnent, avec les groupements silanols superficiels, des interactions polaires supplémentaires qui peuvent améliorer la rétention des composés contenant des fonctionnalités polaires.
Pour un même éluant, plus la chaîne carbonnée est courte, plus la rétention d’un composé est faible.
Pour les composés aromatiques, le greffage phényl présente de meilleures interactions.
Le méthanol ou l’acétonitrile sont des solvants d’élution régulièrement utilisés.

b. Silices pour mode “Phase Normale”

Le mode “phase normale” reste un compromis très intéressant pour la purification de molécules ou familles de molécules dont la structure présente un grand nombre de fonctions polaires. Le choix du solvant est très important et influe directement sur le type d’interaction mis en oeuvre pour la purification (un solvant apolaire favorise les interactions polaires entre l’adsorbant et les composés).

• Le greffage cyano (CN) peut être utilisé soit en “phase normale” pour l’extraction de composés polaires soit en “phase inverse” pour les molécules moyennement polaires.
• La silice greffée Diol se présente comme une très bonne alternative à la silice vierge pour l’extraction de composés polaires (liaisons hydrogène).
• Phase mixte, la silice amino (NH2) peut s’utiliser comme un échangeur d’anions faible (pour les acides très forts) ou comme un adsorbant polaire qui peut interagir avec les groupements fonctionnels -OH, -NH, -SH-, …

c. Silices pour mode “Echange d’ions”

En mode “échange d’ions”, le mécanisme de rétention est l’interaction ionique. L’extrémité du greffon de l’adsorbant crée une attraction forte avec le ou les composés de l’échantillon possédant une ou des fonctions ionisables antagonistes. L’interaction des phases échangeuses d’ions dépend essentiellement du pH et de la force ionique du contre-ion. La force de la liaison sera d’autant plus importante que l’acide et la base qui s’apparient sont forts, ce qui peut être problématique pour l’étape d’élution et pour l’obtention d’un bon taux de recouvrement.

C’est pourquoi il existe différents greffons échange d’ions :

• Les phases échangeuses d’anions (SAX) sont généralement une amine quaternaire très forte. Elles sont utilisées pour extraire les acides faibles portant une ou des charge(s) négative(s).
• Les phases échangeuses de cations (SCX) ayant une fonctionnalité sulfonique sont utilisées pour extraire tous les composés basiques faibles portant une ou des charge(s) positive(s).
• Les phases échangeuses d’anions, (DEAE, DEA, NH2,…) sur une base d’amine moins forte que le SAX, sont utilisées pour extraire les acides forts portant une ou des charge(s) négative(s).
• Les phases échangeuses de cations (WCX) sont fonctionnalisées par un acide carboxylique et sont utilisées pour extraire tous les composés basiques forts portant une ou des charge(s) positive(s).

d. Silices pour mode “Mixed Mode”

Une des techniques les plus sélectives des adsorbants silices greffées est celle du “mode mixte” ou “mixed mode”. Le double greffage (échange d’ions et chaînes carbonées hydrophobes) apporte de nouvelles sélectivités. Les composés d’intérêt, qui doivent impérativement posséder une fonction acide ou basique, sont retenus sur le greffage échange d’ions. Un premier lavage puissant faisant intervenir le pH permet d’éliminer les impuretés ionisables. Il est ensuite possible d’éliminer les autres impuretés retenues sur le greffage hydrophobe par un solvant organique. Cette technique est très utilisée pour l’extraction de composés basiques (médicaments, drogues et métabolites) dans les fluides biologiques (sang, plasma, urines, …).

Comme en “échange d’ions”, il existe différents greffons spécifiques aux composés d’intérêt :
Les phases “mixed mode” (RP/SCX) sont constituées d’un acide fort (sulfonique) et d’un greffon hydrophobe. Elles sont utilisées pour extraire les bases faibles portant une ou des charge(s) négative(s).

• Les phases “mixed mode” (RP/SAX) sont sur une base d’amine quaternaire et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les acides faibles portant une ou des charge(s) négative(s).
• Les phases “mixed mode” (RP/WCX) sont constituées d’un acide faible (carboxylique) et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les bases fortes portant une ou des charge(s) négative(s).
• Les phases “mixed mode” (RP/NH2) sont sur une base d’amine faible et de greffons hydrophobes. Elles sont utilisées pour extraire les acides forts portant une ou des charge(s) négative(s).

4. La répartition en fonction du pH de la proportion acide/base conjuguée d’un composé ionisable acide (rouge) et basique (bleu) en solution

5. La sélectivité relative des contre ions

Un contre-ion est une espèce chimique ionique capable de s’apparier sur un échangeur d’ions. En fonction de sa concentration en solution et de son affinité avec l’échangeur, il améliore l’efficacité des étapes de lavages et d’élutions.